Proteomik und Bioanalytik

Durch die Veränderung der Aminosäure-Seitenketten oder der Länge des Peptidrückgrats weisen verschiedene Proteoformen, die aus einer einzigen kodierten Proteinsequenz entstehen, unterschiedliche physikalisch-chemische Eigenschaften wie Molekularmasse, Nettoladung oder Hydrophobie auf. Diese Eigenschaften beeinflussen die Proteinfaltung und bestimmen letztlich die Struktur der Proteoformen. Da die Struktur und die physikalisch-chemischen Eigenschaften die Proteinfunktion bestimmen, können verschiedene Proteoformen eines bestimmten Proteins unterschiedliche molekulare Funktionen haben und an völlig unterschiedlichen biologischen Prozessen beteiligt sein. Proteoformen eines bestimmten Proteins können sich in ihrer subzellulären Lokalisierung und ihren Interaktionspartnern unterscheiden und modifizierte (z. B. Enzymkinetik) oder völlig andere biologische Aktivitäten aufweisen.

Daher ist die Kenntnis der Proteoformen innerhalb eines biologischen Systems unerlässlich, um die molekularen Prozesse zu verstehen, die die Biologie antreiben. Da sich diese Informationen weder aus genomischen noch aus transkriptomischen Daten ableiten lassen, sind proteomische Technologien erforderlich, um Proteoformen in komplexen biologischen Umgebungen zu identifizieren, zu quantifizieren und zu charakterisieren und so ihre Rolle in biologischen Prozessen aufzuklären.

Derzeit ist die Bottom-up-Proteomik (BUP) der vorherrschende Ansatz in der Proteomanalyse. Der Bottom-up-Arbeitsablauf umfasst den proteolytischen Abbau von Proteinen in Peptide unter Verwendung einer aktiven Protease, gefolgt von der Trennung des komplexen Peptidgemischs, z. B. mittels Flüssigchromatographie (LC), und einer massenspektrometrischen (MS) Analyse zur Bestimmung der Peptidmassen und zur Ableitung von Peptidsequenzinformationen (MS/MS). Ein entscheidender Schritt bei der BUP ist die Ableitung von Informationen auf Proteinebene aus den Peptiddaten. Dieser Prozess, die Proteinkonjektur, ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung von Proteingruppen; wie jedoch in Abbildung 2 dargestellt, gehen Informationen über die nativen Proteoformen aufgrund des proteolytischen Aufschlusses verloren.

Zwar ist die BUP eine etablierte und empfindliche Technologie, doch der Verlust von Informationen auf Proteoform-Ebene macht alternative analytische Ansätze erforderlich. Die Top-down-Proteomik (TDP) schließt diese Lücke. Bei der TDP erfolgt die Analyse auf der Ebene intakter Proteine, wodurch a priori alle Informationen über eine Proteoform innerhalb eines einzelnen Moleküls erhalten bleiben. Zwar ist die direkte Analyse intakter Proteine anstelle von verdauten Peptiden intuitiv, doch haben zahlreiche analytische Herausforderungen in der Vergangenheit den breiten Einsatz dieser Technologie verhindert. Wesentliche Herausforderungen, von denen hier nur eine Auswahl aufgeführt ist, treten auf allen Ebenen der analytischen Pipeline auf: (1) Probenvorbereitung: verminderte Löslichkeit intakter Proteine, wenn sie aus ihrer zellulären Umgebung freigesetzt werden; (2) die Trennung intakter Proteine mittels LC ist weniger unkompliziert als die von Peptiden; (3) MS und MS/MS: geringere Empfindlichkeiten, z. B. aufgrund der breiten Ladungszustandsverteilung bei der Elektronenspray-Ionisation (ESI)-MS; die Notwendigkeit effizienter, aber dennoch fehleranfälliger Dekonvolutionsalgorithmen; die Notwendigkeit hochauflösender MS-Geräte; sehr komplexe MS/MS-Spektren, oft mit unvollständigen Ionenreihen; (4) Dateninterpretation: Fehlen von Algorithmen zur Datenintegration; Fehlen definierter Kriterien zur Datenkuratierung (z. B. Falsch-Entdeckungsraten). Die Bewältigung dieser Herausforderungen im Bereich TDP ist ein Hauptziel unserer Forschung.

Proteolytische Verarbeitung oder alternative Start-/Stoppcodons können zur Bildung verkürzter Proteoformen oder von Proteoformen mit nicht-kanonischen N- oder C-Termini führen. Für die proteomweite Identifizierung von N- und C-Termini wurden N- und C-Terminomik-Ansätze entwickelt, die hauptsächlich auf BUP basieren. Demgegenüber identifiziert TDP a priori die intakte Proteoform und damit beide Termini in einer gegebenen Proteoform. Unsere Gruppe arbeitet an der Verbesserung von BUP-basierten Terminomik-Ansätzen und an der Integration mit TDP (integrative mehrstufige Proteoformik).

Anwendungsorientierte Projekte (Beispiele)

• Peptide, die von kurzen offenen Leserahmen kodiert werden (SEP), Mikroproteine und Proteine, die von alternativen ORFs kodiert werden (altProt).
• Antimikrobielle Peptide.
• Amyloid-Proteomik.
• Untersuchungen zum Wirkmechanismus neuer Arzneimittel: Identifizierung von Zielmolekülen und Off-Targets auf Proteoform-Ebene.
• Räumliche Proteomik.
• Immunpeptidomik.
• Paläoproteomik.